PCR product purification
마이크로 피펫과의 기나긴 한판 승부!!
B. Agarose gel에서 DNA의 용출
DNA를 전기영동하여 관찰되는 band 중에서 특정한 band를 gel로부터 유리해낼 수가 있다. 이 방법은 재조합 DNA를 만들때 대단히 중요하게 쓰이는 기술이므로 보다 회수율이 높고 용출(elution)된 DNA의 순수도가 보다 높고, 또한 보다 빠르고 간편하게 실행할 수 있는 방법이 계속적으로 개발되고 있다. Gel에서 DNA를 회수하는 많은 방법 중에서 대표적인 방법은 다음과 같다.
1) 전기영동에 의한 DEAE-cellulose membrane 위로 DNA 조각의 이동
2) 투석 주머니속에서의 전기 용출(electroelution)
3) Low melting agarose gel로부터 DNA 용리
4) Gene Clean kit를 이용한 추출
5) QIAquick kit(QIAGEN)를 이용한 추출
DEAE-cellulose membrane 위에서의 전기영동은 여러 DNA를 동시에 분리하고 0.5 kb~5 kb 크기의 DNA를 분리함에 있어서 효율성이 높은 비교적 간단한 방법이다. Membrane으로부터 분리되는 DNA는 순도가 높으므로 거의 모든 용도로 사용이 가능하다. 투석 주머니속에서의 전기 용리는 현재까지 알려진 가장 불편한 방법이지만 5 kb보다 큰 DNA 조각들을 분리하는 데에는 가장 효과적인 방법이고 순수도가 높다. 낮은 온도에서 녹는 agarose gel로부터 DNA를 분리하는 방법은 위의 두 방법에 비해 분리되는 DNA 양이 적지만 제한효소나 ligation에 필요한 효소를 gel에 직접 처리할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 그러나 요즘 실험실에서는 kit를 이용한 방법이 가장 많이 쓰인다. 무엇보다도 빠르고 간편하며 회수율과 순수도도(계속 개발되고 있음) 높기 때문이다.
1) Gene Clean kit를 이용한 추출
Gene Clean kit에는 glassmilk라는 silica matrix가 들어 있다. Glassmilk는 쌍가닥 또는 외가닥 DNA에만 특이하게 결합하므로 DNA를 신속하게 분리할 수 있다. DNA 분리에 필요한 시간은 보통 15∼20분 정도이며, DNA 회수율은 80%(크기가 500 염기쌍 이하이면 효율은 더 낮아진다), 순수도는 cesium chloride를 이용하여 원심분리한 경우와 비슷하거나 더 좋은 편이다.
실험방법
1. 적어도 100 ng 정도 되는 DNA band를 날카로운 칼로 잘라내어 미세원침관으로 옮긴 다음 gel의 무게를 재고 3배 무게만큼 6 M NaI 용액을 첨가한다. 즉 200 mg의 gel 조각에 600 μl의 용액을 첨가한다.
2. 45∼55°C에 10분 두어 gel을 완전히 녹인다. 2~3분마다 원침관을 흔들어 섞어준다.
3. Glassmilk를 5 μl 첨가한 후 진탕하여 섞는다. Glassmilk는 무거워 가라앉아 있으므로 잘 섞어서 사용해야 한다.
* Glassmilk 1 μl는 1 μg 정도의 DNA와 결합한다. DNA양이 소량인 경우에도 기본적으로 5 μl을 첨가하는 것이 좋으며 5 μg 이상이 되면 추가되는 DNA 1 μg 당 glassmilk 1 μl를 첨가한다.
4. 실온 또는 얼음에서 5분 두어 DNA와 glassmilk가 결합되게 한다. 조심스럽게 흔들어 주어도 좋다.
5. 실온에서 최고속도로 15초동안 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 상층액을 제거한다.
6. 세척용액(washing solution) 500~800 μl를 첨가한 후 진탕하여 잘 섞는다.
* 세척용액(50% ethanol, 10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl)은 상품 구입시에 ethanol을 제외한 stock solution형태로 제공된다. 설명서를 참고하여 ethanol과 증류수로 만든 용액은 -20°C에 보관하였다가 필요한 경우에만 꺼내어 사용한다.
* 5 kb 이상인 DNA를 gene clean하는 경우에는 진탕하지말고 pipetting으로 조심스럽게 부유하는 것이 좋다. 심하게 vortex하면 DNA가 부서질 위험이 있다.
7. 다시 위와같이 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 상층액을 제거한다.
8. 위의 6, 7 과정을 2회 더 반복한다.
9. 상층액을 완전히 제거한 후 10~20 μl의 증류수(또는 TE, pH 8.0)를 첨가하여 섞은 후, 45∼55°C water bath에 5분간 둔다. 이 과정에서 glassmilk와 결합해 있던 DNA가 증류수로 녹아나온다.
10. 실온에서 15,000 rpm으로 30초동안 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 DNA가 녹아 있는 상층액을 조심스럽게 새 미세원침관으로 옮긴다.
* 이 과정에서 한번 용출한 DNA는 처음 양에 비하여 약 80% 정도가 된다. 9, 10 과정을 한번 더 반복하면 거의 95% 이상의 회수율을 얻을 수 있다고 한다.
2) QIAquick kit를 이용한 추출
이 kit는 silica-gel membrane을 이용한 column에 DNA가 결합함을 이용한 것이다. 회수율과 순수도가 높고 아주 간편하여 많이 쓰고 있다. 이 kit에 포함된 용액들은 그 성분을 정확히 공개하지 않고 있다.
실험방법
1. DNA band를 날카로운 칼로 잘라내어 미세원침관으로 옮긴 다음 gel의 무게를 재고 3배 무게만큼 QX1 용액을 첨가한다. 즉 200 mg의 gel 조각에 600 μl의 용액을 첨가한다.
* 2% 이상의 agarose gel인 경우 6배의 용액을 쓴다. 또 만약 gel 무게가 400 mg이 넘으면 여러개로 나누어서 실험한다.
2. 50°C에 10분 두어 gel을 완전히 녹인다. 2~3분마다 원침관을 흔들어 섞어준다.
3. 처음 gel 무게만큼 isopropanol을 첨가하고 섞는다. (200 mg이면 200 μl)
4. QIAquick spin column을 collection tube에 설치하고 DNA 용액을 첨가한 다음 12,000 rpm에서 1분간 원심분리한다.
5. 밑으로 빠진 용액을 버리고 다시 위치시키고 0.5 ml의 QX1 용액을 첨가하고 다시 원심분리한다.
6. 세척을 위해 0.75 ml의 PE 용액을 가하고 다시 원심분리한다. 여기에서 빠진 용액을 버리고 그대로 다시 1분간 원심분리하여 완전히 용액을 제거한다. 이때, column 가장자리의 턱에 걸린 용액이 아주 소량 남으므로 이를 흡입기나 pipette을 이용하여 제거한다.
7. Column을 새 미세원침관에 설치하고 증류수나 TE, pH 8.0 50 μl를 중앙 membrane에 떨어뜨리고 1분간 최고속도로 원심분리한다. 만약 30 μl를 쓰는 경우는 용액을 떨어뜨린 후 1분간 두었다가 원심분리한다. 용출된 부피는 약 2~3 μl 줄어있게 된다.