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  1. 2008.03.01 Determination of DNA Concentration and Purity
DNA 혹은 oligonucleotide(ODN)의 정량/정성 분석에 대한 자세한 한글 기술 내용을 찾기가 힘들어 한번 정리해 봅니다.
본인이 3000bp 미만의 dsDNA 나 12mer 미만의 oligonucleotide를 주로 다루는 관계로 무지 큰 DNA나 RNA에 대한 언급은 참고 자료에 나온 정도로만 마치겠습니다.

[배경지식]

그림1. ODN의 흡광 스펙트럼 - Biochemistry, Lehninger (2005)

pyrimidine(피리미딘) 과 purine(퓨린)은 약한 염기성 화합물로서 base(염기) 라고 부릅니다. 위 그림은 pH7.0에서 UV에 의해 얻어지는 ODN의 흡광 스펙트럼입니다. 보시는 바와 같이 260nm 에서 아주 강한 흡광도를 가지는데, 이를 기초로 DNA혹은 RNA의 농도를 측정할 수 있는 것입니다. 순도는 DNA와 RNA의 흡광 스펙트럼에서 260nm에서의 흡광도가 280nm 의 약 2배 라는 사실에 의거하여 분석할 수 있습니다.

[실험방법]
1. 원하는 샘플을 큐벳(cuvett)이나 플레이트(96- or 384-well plate)에 알맞은 부피를 채워 UV/Vis spectrometer로 220-320nm 영역의 흡광도를 측정합니다 (Spectrum을 측정하지 못하는 기기의 경우 220, 260, 280nm 의 값을 각각 측정합니다). 이 때, 샘플을 희석하여 흡광도가 0.050~0.100의 값을 가지도록 합니다.
* 여기서 반드시 만국 공통인 빛의 통과거리가 1cm인 큐벳을 이용하거나 (Beer-Lambert Law) 플레이트 이용시에는 제조사의 기술문서를 참고하여 적당한 부피를 가지고 실험합니다.

[계산]

1. concentration 농도
희석된 배율 * OD(at 260nm) =  final OD
위에서 얻은 OD 값을 가지고 molecular extinction coefficient 를 통해 계산하거나, 편리하게 구성된 계산기 (ODN의 경우 http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html )의 도움으로 농도, 혹은 시료의 양을 계산합니다.

2. purity 순도
간단히 말하자면 OD260 / OD280의 비율(ratio)을 계산하여 그 값으로 시료의 순도를 분석할 수 있습니다.
알맞는 비율은 1.8-2.0 입니다.
만약 그 값이 1.8보다 작다면 protein 이나 carbohydrate 등의 물질이 섞여 있는것을 의미하며, 2.0보다 크다면 Chloroform 혹은 phenol 등의 유기물질이 섞여 있다고 할 수 있습니다. (그림 2.)

그림2. DNA 시료의 농도/순도 측정 - http://www.med.upenn.edu/dnaseq/services/temprep-instr.html



Posted by k3mi5t
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