(1) Prepare a gel image you want to analyze (Fig.1).
Figure 1. A gel image from camera. Lane1 and 2: reference 11mer oligonucleotide(ODN) and chemically modified 11mer to lower the electrophoretic mobility, respectively. Lane 3-4: hybridized with single-base mismatch sequence at the second 5'-end. Lane 5: hybridized with noncomplementary sequence.
(2) Open the image in imageJ.
(3) Select a rectangular area which vertically covers the area you are interested in (Fig.2).
(4) Then select "Analyze > Gels > Select First Lane" in imageJ's menu. Number 1 will appear on the image.
Figure 2. Select a rectangular area
(5) Move the selection to the next lane by dragging the rectangle. Then select "Analyze > Gels > Select Next Lane". The next number will appear on the image.
(6) Repeat no. 5.
* Do not contain any whitehole, brighter area cause by residual staining dye shown on out-left of lane 5, while selecting the lane. Selecting the defect will induce errors in the analysis.
Figure 3. Identify next lanes.
(7) In the menu, select "Analyze > Gels > Plot lanes". This will produce new image (Fig.4). Inverted gel images may look different.
Figure 4. Plotted lanes in order of selected lanes. The left is upper part of the gel selection. Intenser band will make deeper valley on each section.
(8) Open the plotted image in an image processing software; Adobe photoshop was used here. Make the color profile to RGB mode and make new layer.
* If you are only interested in electrophoretic mobility, measuring distance from side edges will just do.
(9) Using pencil tool or paint bucket, color the bands of your interest (Fig.5)
Figure 5. Coloring a band in photoshop.
(10) Repeat no. 9 on other bands using different colors (Fig.6).
Figure 6. Coloring bands in different colors.
(11) Make the colored layer visible only. Export as a GIF image (Save for Web & Devices in photoshop is easier) (Fig.7). While exporting, check if the exporting format is gif and the number of colors are larger then that of above image.
Figure 7. Exported GIF image.
(12) Open image area analyzer (http://mkwak.org/imgarea/), and upload the gif image. You will see the result in a second (Fig.8).
Figure 8. Analysis of area upon colors.
(13) Calculate the area to extract some meaningful numbers (Fig.9).
Figure 9. Analysis of the area vs. mobility.
(14) Analyze the result.
Conclusion
Single-base mismatch sequences (lane 3-4) hybridized in different conditions exhibit 63-70% hybridization while a noncomplementary sequence (lane 5) has much lower (27%) binding. One needs to perform same experiment with fully matching complementary sequence to conclude this result.
Agarose gel electrophoresis is a method used in molecular biology to separate DNA strands by size, and to estimate the size of the separated strands by comparison to known fragments (DNA ladder). This is achieved by pulling negatively charged DNA molecules through an agarose matrix with an electric field. Shorter molecules move faster than longer ones.
>>Agarose gel 전기영동
시판되는 agarose는 완전히 순수 분리된 것은 아니며 다른 다당류나, 염, 단백질 등이 혼합되어 있으며, 이런 물질들이 포함된 정도에 따라 전기영동시 DNA가 이동되는 정도나 DNA가 gel에서 분리되는 정도가 달라진다. 따라서 효소 억제제와 nuclease가 함유되어 있지 않으며 ethidium bromide로 염색할 경우 형광의 배경을 극소로 하기 위한 특별히 정제된 agarose를 구입하여 사용한다.
Gel의 기능을 유지하면서 낮은 온도에서도 녹을 수 있게 화학적으로 변형된 low melting agarose는 gel에서 쉽게 DNA를 용리할 수 있도록 고안된 것인데 현재는 잘 사용되지 않는다. 또 일부 시약회사에서는 아주 작은 DNA 조각(10∼500 bp)을 분석할 때 이용할 수 있는, 낮은 온도에서 gel을 형성하는 agarose를 시판하고 있는데 이와 같은 agarose는 일반적으로 사용되는 agarose보다는 DNA가 잘 분리되지만 polyacrylamide를 이용하여 얻은 결과보다는 그 분리되는 정도가 낮다. 이러한 gel은 agarose의 농도를 높게 하여 사용하므로(4∼10%) DNA 조각들을 gel에서 용출한 후에 제한효소를 처리하면 효소작용이 억제되는 수가 많다.
Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.
7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
* 여러 DNA 형태를 알아내기 위한 확실한 방법은 ethidium bromide의 양을 증가시켜 전기영동을 시행하는 것이다. Ethidium bromide의 농도가 증가하면 더 많은 ethidium bromide가 DNA와 결합하게 된다. Supercoiled DNA에서 negative superhelical turn은 차차 제거되고 반지름이 증가하게 되어 이동속도는 느려지게 된다. Superhelical turn이 남아있지 않은 적절한 색소의 농도에서 이동속도는 가장 느리다. 여기에 더 많은 ethidium bromide가 첨가되면 positive superhelical turn이 생기게 되고 DNA 분자는 더 치밀해지며 이동속도는 급속도로 빨라진다. Linear와 open circular DNA의 이동은 DNA가 중성의 전하를 띠거나 ethidium bromide에 의해 굳어지는 경우에 이동속도가 느려진다.
* 낮은 전압에서 선형으로 된 DNA 조각의 이동속도는 부하되는 전압에 비례한다. 그러나, 전기장에서 전류의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA 조각의 이동속도는 빨라지게 되므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA 분리 효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA 조각들의 분리를 최대로 하기 위해서는 agarose gel에 5 V/cm 이상의 전압을 부하시켜서는 안된다.
A. Agarose gel 전기영동
실험방법
1. 깨끗하고 건조한 유리판(또는 전기영동 기구에 꼭 맞게 만들어진 플라스틱판) 사방 모서리를 주형의 모양이 되도록 테이프로 감은 후 수평으로 맞추어진 판 위에 주형을 둔다.
* 테이프로 감을 필요가 없는 기구가 요즈음 많이 시판되고 있다.
2. 전기영동 tank를 채우고 gel 제조에 이용하기 위한 전기영동 완충용액(1x TAE)을 충분히 준비한다. 다음 표를 이용하여 분리하고자 하는 DNA 크기에 해당하는 양의 agarose 분말과 완충액을 삼각 플라스크 또는 유리병에 담는다.
[#M_Agarose Gel Electophoresis (Korean)|less..|
Amount of agarose in gel
(%[w/v])
Efficient range of separation oflinear DNA molecules (kb)
0.3
5~60
0.6
1~20
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7
1.2
0.4~6
1.5
0.2~3
2.0
0.1~2
* 1x TAE 용액은 먼저 50x 용액을 제조한 다음 희석해서 쓴다. 50x TAE 1 liter를 제조하기 위해서는 Tris 242 g, glacial acetic 57.1 ml, 0.5 M EDTA, pH 8.0 100 ml를 녹여 증류수로 1 liter까지 채운다.
* 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다.
3. Microwave oven를 이용하여 agarose가 녹을 때까지 서서히 가열한다.
처음에는 녹지 않지만 녹은 후에는 투명하게 된다.
Electrophoresis buffer solution
Electrophoresis를 할 때 gel이 잠기는 buffer solution에는 여러가지가 있으나 주로 TAE와 TBE가 많이 쓰입니다. TAE는 주로 agarose electrophorsis에, TBE 는 DNA sequencing에 쓰입니다. 조성은 다음과 같으며 대량을 쓰므로 미리 많이 만들어놓고 필요할 때마다 희석해서 부어서 씁니다.
Commonly used electrophoresis buffers
Buffer
Concentrated stock solution (per liter)
Tris-acetate (TAE)
50x
242 g Tris base
57.1 ml glacial acetic acid
100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
Generally used for agarose EP
Tris-borate (TBE)
20x
121.1 g Tris base
61.7 g boric acid
7.44 g Na2EDTA-2H2O
Generally used for DNA sequencing
Gel loading buffer
그리고 DNA 시료를 담는 loading buffer가 필요합니다. 이 buffer는 분자량이 큰 glycerol 등 무거운 물질이 함유되어 있어서 DNA가 든 시료를 gel 속에 잘 가라앉히고, 파란색을 내는 bromophenol blue가 들어 있어서 electrophoresis하는 동안에 현재 어느 정도 진행되어 있나 눈으로 보아 알 수 있게 해 줍니다. 다음과 같은 몇몇 종류가 쓰입니다.
Gel loading buffers (6x)
[#M_Agarose Gel Electophoresis (Korean)|less..|
I
0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
40%(w/v) sucrose in water
II
0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
15% Ficoll(Type 400) in water
III
0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
30% glycerol in water
IV
0.25% bromophenol blue
40%(w/v) sucrose in water
4. 용액을 60°C까지 식힌다. 필요하면 ethidium bromide를 최종농도 0.5 μg/ml이 되도록 가하고 잘 혼합한다.
* Ethidium bromide(EtBr)은 DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진 그룹을 지니고 있어서 이 그룹이 DNA 염기에 결합하면 유리형의 ethidium bromide보다 형광이 증가된다. 파장 254 nm에서의 자외선은 DNA에 흡수되어 이 색소에 전달되고 파장이 302 nm와 366 nm에서는 색소 자체에 자외선이 흡수되어 590 nm의 주황색 형광 가시광선을 내게 된다. Ethidium bromide는 한가닥과 쌍가닥 DNA및 RNA 검색에 모두 사용할 수 있으나 염료의 친화성이 외가닥에서보다 쌍가닥에서 더 강하다.
* Ethidium bromide 원액은 증류수에 10 mg/ml로 녹아 있는 용액으로, 이 용액의 보관은 빛이 차단된 용기에 담아서 실온에 보관한다. 이 원액을 0.5 μg/μl로 희석해 두고 이를 gel에 혼합한다.
* 주의: Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 이 염색액을 다룰 때에는 반드시 비닐장갑을 사용한다. 사용 후에 이 용액은 정화한 후 버려야 한다.
5. Comb을 agarose를 모두 부었을 때 주형의 밑바닥으로부터 0.5∼1.0 mm정도 떨어져서 위치하여 홈을 형성할 수 있도록 고정시킨다.
6. 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붇는다. Gel은 3∼5 mm 두께가 되도록 하고 기포가 생기지 않도록 주의한다.
7. 실온에서 20∼30분 두어 gel이 완전히 굳은 후 comb과 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 gel을 전기영동 tank안에 설치한다.
* 0.5% 이하인 낮은 농도를 가진, 낮은 온도에서 녹는 agarose로 제조한 gel은 4°C 이하에서 굳힌 다음 냉장실에서 전기영동해야 한다.
8. Gel을 1 mm 정도의 두께로 덮을 수 있을 정도로 충분한 양의 전기영동 완충용액(1x TAE)을 가한다.
9. DNA 시료를 전기영동용 loading 완충용액과 혼합한 후 pipette을 이용하여 잠겨있는 gel의 홈에 혼합액을 조심스럽게 가한다.
* 전기영동용 loading 완충용액은 보통 6x로 제조하여 사용한다. 여러가지 종류가 있는데 우리 실험실에서는 type II (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll[type 400, Pharmacia]을 증류수에 녹인 것. Ficoll이 잘 안녹으므로 50°C에 약 1시간 두어 녹인다)를 쓴다. 만약 DNA 용액이 20 μl이면 6x 용액을 4 μl 첨가하면 된다.
* 전기영동할 수 있는 DNA의 최고량은 DNA의 크기나 조각의 수에 따라 달라지며, ethidium bromide로 염색하여 사진상으로 판독할 수 있는 최소량은 0.5 cm 넓이(일반적으로 사용되는 넓이)의 홈 하나당 2 ng 정도라고 한다. 0.5 cm 넓이의 홈에 DNA가 500 ng이상 존재하면 DNA 양이 너무 많아서 DNA 띠가 끌려 선명치 않게 나타나며, 이 현상은 DNA 크기가 클수록 심해진다. 보통 DNA 분자는 0.5 cm 홈 하나당 100∼200 ng이면 분석 가능하다. 시료가 여러가지 다른 크기로 된 많은 DNA 조각들로 구성되어 있을 때(예: genomic DNA를 제한 효소로 절단할 때) 홈당 20∼30 μl의 DNA를 가하여 분석할 수 있다.
* 한 홈에 가할 수 있는 최대부피는 홈의 3차원적 크기에 따라 결정된다. 예를 들면 일반적으로 사용되는 0.5 cm x 0.5 cm x 0.15 cm의 홈에는 37.5 μl를 가할 수 있다. 그러나, 옆의 홈에 가한 시료와 혼합되는 것을 막기 위하여 gel을 좀 더 두껍게 제조하거나 DNA를 에탄올로 침전시켜 DNA 부피를 줄여서 가하는 것이 좋다.
* 시판되는 알려진 크기의 표준 DNA를 크기 표식자를 같이 전기영동하여 모르는 DNA의 크기를 측정할 수 있다. 크기의 비교가 가능한 것은 linear DNA임을 주의한다. 주로 많이 사용되는 표식자에는 1 kb ladder, 123 bp ladder, λ Hind III ladder(전기영동 패턴 보기) 등이 있다.
10. Gel tank의 뚜껑을 닫고 DNA가 양극 쪽으로 이동해갈 수 있도록 양극에 빨간 도선을, 음극에 검정 도선을 연결하고, 전극간의 거리 1 cm당 1∼5 V의 전압을 가한다.
* 전기영동을 시작하면 전기분해에 의하여 양극과 음극에서 기포가 발생하고 시약에 섞인 염료가 홈으로부터 이동해가는 것이 보인다. Bromophenol blue와 xylene cyanol FF가 적당한 거리만큼 이동해갈 때까지 전기영동을 시행한다.
* 전기영동하는 동안 ethidium bromide는 음극 쪽으로(DNA와 반대 방향으로) 이동해 가므로 오랫동안 전기영동을 하면 ethidium bromide는 gel에서 모두 빠지게 되어 작은 DNA 조각을 감지하기가 어렵게 된다. 이렇게 되는 경우에는 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 증류수나 1x TAE 용액에 30∼45분간 담가 염색하였다가 관찰하면 된다.
* Gel에 ethidium bromide가 함유되어 있으면 전기영동하는 동안 어느 시기에나 자외선하에서 관찰이 가능하다. 그러나, gel에 ethidium bromide를 함유시키지 않고 전기영동한 후 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 용액에 30~45분간 더 염색하였다가 관찰하는 것이 더 선명한 DNA 띠를 관찰할 수 있다는 이유로 후자를 선호하는 실험자들도 있다. 이 때 탈색 과정은 보통 필요치 않으나, 10 ng 이하의 적은 양의 DNA를 검출할 때에는 결합하지 않은 ethidium bromide가 gel에 묻어 있으면 바탕이 흐려 보이므로 증류수나 1mM MgSO4에 담가 실온에서 20분간 탈색하면 DNA를 더 선명하게 관찰할 수 있다.
11. 전기영동이 끝나면 전기를 끄고 도선을 제거한 후 gel tank의 뚜껑을 연 다음 gel을 자외선하에서 관찰하고 촬영한다.
