B. Agarose gel에서 DNA의 용출

DNA를 전기영동하여 관찰되는 band 중에서 특정한 band를 gel로부터 유리해낼 수가 있다. 이 방법은 재조합 DNA를 만들때 대단히 중요하게 쓰이는 기술이므로 보다 회수율이 높고 용출(elution)된 DNA의 순수도가 보다 높고, 또한 보다 빠르고 간편하게 실행할 수 있는 방법이 계속적으로 개발되고 있다. Gel에서 DNA를 회수하는 많은 방법 중에서 대표적인 방법은 다음과 같다.

1) 전기영동에 의한 DEAE-cellulose membrane 위로 DNA 조각의 이동
2) 투석 주머니속에서의 전기 용출(electroelution)
3) Low melting agarose gel로부터 DNA 용리
4) Gene Clean kit를 이용한 추출
5) QIAquick kit(QIAGEN)를 이용한 추출

DEAE-cellulose membrane 위에서의 전기영동은 여러 DNA를 동시에 분리하고 0.5 kb~5 kb 크기의 DNA를 분리함에 있어서 효율성이 높은 비교적 간단한 방법이다. Membrane으로부터 분리되는 DNA는 순도가 높으므로 거의 모든 용도로 사용이 가능하다. 투석 주머니속에서의 전기 용리는 현재까지 알려진 가장 불편한 방법이지만 5 kb보다 큰 DNA 조각들을 분리하는 데에는 가장 효과적인 방법이고 순수도가 높다. 낮은 온도에서 녹는 agarose gel로부터 DNA를 분리하는 방법은 위의 두 방법에 비해 분리되는 DNA 양이 적지만 제한효소나 ligation에 필요한 효소를 gel에 직접 처리할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 그러나 요즘 실험실에서는 kit를 이용한 방법이 가장 많이 쓰인다. 무엇보다도 빠르고 간편하며 회수율과 순수도도(계속 개발되고 있음) 높기 때문이다.

1) Gene Clean kit를 이용한 추출

Gene Clean kit에는 glassmilk라는 silica matrix가 들어 있다. Glassmilk는 쌍가닥 또는 외가닥 DNA에만 특이하게 결합하므로 DNA를 신속하게 분리할 수 있다. DNA 분리에 필요한 시간은 보통 15∼20분 정도이며, DNA 회수율은 80%(크기가 500 염기쌍 이하이면 효율은 더 낮아진다), 순수도는 cesium chloride를 이용하여 원심분리한 경우와 비슷하거나 더 좋은 편이다.

실험방법

1. 적어도 100 ng 정도 되는 DNA band를 날카로운 칼로 잘라내어 미세원침관으로 옮긴 다음 gel의 무게를 재고 3배 무게만큼 6 M NaI 용액을 첨가한다. 즉 200 mg의 gel 조각에 600 μl의 용액을 첨가한다.

2. 45∼55°C에 10분 두어 gel을 완전히 녹인다. 2~3분마다 원침관을 흔들어 섞어준다.

3. Glassmilk를 5 μl 첨가한 후 진탕하여 섞는다. Glassmilk는 무거워 가라앉아 있으므로 잘 섞어서 사용해야 한다.

* Glassmilk 1 μl는 1 μg 정도의 DNA와 결합한다. DNA양이 소량인 경우에도 기본적으로 5 μl을 첨가하는 것이 좋으며 5 μg 이상이 되면 추가되는 DNA 1 μg 당 glassmilk 1 μl를 첨가한다.

4. 실온 또는 얼음에서 5분 두어 DNA와 glassmilk가 결합되게 한다. 조심스럽게 흔들어 주어도 좋다.

5. 실온에서 최고속도로 15초동안 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 상층액을 제거한다.

6. 세척용액(washing solution) 500~800 μl를 첨가한 후 진탕하여 잘 섞는다.

* 세척용액(50% ethanol, 10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl)은 상품 구입시에 ethanol을 제외한 stock solution형태로 제공된다. 설명서를 참고하여 ethanol과 증류수로 만든 용액은 -20°C에 보관하였다가 필요한 경우에만 꺼내어 사용한다.

* 5 kb 이상인 DNA를 gene clean하는 경우에는 진탕하지말고 pipetting으로 조심스럽게 부유하는 것이 좋다. 심하게 vortex하면 DNA가 부서질 위험이 있다.

7. 다시 위와같이 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 상층액을 제거한다.

8. 위의 6, 7 과정을 2회 더 반복한다.

9. 상층액을 완전히 제거한 후 10~20 μl의 증류수(또는 TE, pH 8.0)를 첨가하여 섞은 후, 45∼55°C water bath에 5분간 둔다. 이 과정에서 glassmilk와 결합해 있던 DNA가 증류수로 녹아나온다.

10. 실온에서 15,000 rpm으로 30초동안 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 DNA가 녹아 있는 상층액을 조심스럽게 새 미세원침관으로 옮긴다.

* 이 과정에서 한번 용출한 DNA는 처음 양에 비하여 약 80% 정도가 된다. 9, 10 과정을 한번 더 반복하면 거의 95% 이상의 회수율을 얻을 수 있다고 한다.

2) QIAquick kit를 이용한 추출

이 kit는 silica-gel membrane을 이용한 column에 DNA가 결합함을 이용한 것이다. 회수율과 순수도가 높고 아주 간편하여 많이 쓰고 있다. 이 kit에 포함된 용액들은 그 성분을 정확히 공개하지 않고 있다.

실험방법

1. DNA band를 날카로운 칼로 잘라내어 미세원침관으로 옮긴 다음 gel의 무게를 재고 3배 무게만큼 QX1 용액을 첨가한다. 즉 200 mg의 gel 조각에 600 μl의 용액을 첨가한다.

* 2% 이상의 agarose gel인 경우 6배의 용액을 쓴다. 또 만약 gel 무게가 400 mg이 넘으면 여러개로 나누어서 실험한다.

2. 50°C에 10분 두어 gel을 완전히 녹인다. 2~3분마다 원침관을 흔들어 섞어준다.

3. 처음 gel 무게만큼 isopropanol을 첨가하고 섞는다. (200 mg이면 200 μl)

4. QIAquick spin column을 collection tube에 설치하고 DNA 용액을 첨가한 다음 12,000 rpm에서 1분간 원심분리한다.

5. 밑으로 빠진 용액을 버리고 다시 위치시키고 0.5 ml의 QX1 용액을 첨가하고 다시 원심분리한다.

6. 세척을 위해 0.75 ml의 PE 용액을 가하고 다시 원심분리한다. 여기에서 빠진 용액을 버리고 그대로 다시 1분간 원심분리하여 완전히 용액을 제거한다. 이때, column 가장자리의 턱에 걸린 용액이 아주 소량 남으므로 이를 흡입기나 pipette을 이용하여 제거한다.

7. Column을 새 미세원침관에 설치하고 증류수나 TE, pH 8.0 50 μl를 중앙 membrane에 떨어뜨리고 1분간 최고속도로 원심분리한다. 만약 30 μl를 쓰는 경우는 용액을 떨어뜨린 후 1분간 두었다가 원심분리한다. 용출된 부피는 약 2~3 μl 줄어있게 된다.

>>Agarose gel 전기영동

시판되는 agarose는 완전히 순수 분리된 것은 아니며 다른 다당류나, 염, 단백질 등이 혼합되어 있으며, 이런 물질들이 포함된 정도에 따라 전기영동시 DNA가 이동되는 정도나 DNA가 gel에서 분리되는 정도가 달라진다. 따라서 효소 억제제와 nuclease가 함유되어 있지 않으며 ethidium bromide로 염색할 경우 형광의 배경을 극소로 하기 위한 특별히 정제된 agarose를 구입하여 사용한다.

Gel의 기능을 유지하면서 낮은 온도에서도 녹을 수 있게 화학적으로 변형된 low melting agarose는 gel에서 쉽게 DNA를 용리할 수 있도록 고안된 것인데 현재는 잘 사용되지 않는다. 또 일부 시약회사에서는 아주 작은 DNA 조각(10∼500 bp)을 분석할 때 이용할 수 있는, 낮은 온도에서 gel을 형성하는 agarose를 시판하고 있는데 이와 같은 agarose는 일반적으로 사용되는 agarose보다는 DNA가 잘 분리되지만 polyacrylamide를 이용하여 얻은 결과보다는 그 분리되는 정도가 낮다. 이러한 gel은 agarose의 농도를 높게 하여 사용하므로(4∼10%) DNA 조각들을 gel에서 용출한 후에 제한효소를 처리하면 효소작용이 억제되는 수가 많다.

Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들

1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.
7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.

* 여러 DNA 형태를 알아내기 위한 확실한 방법은 ethidium bromide의 양을 증가시켜 전기영동을 시행하는 것이다. Ethidium bromide의 농도가 증가하면 더 많은 ethidium bromide가 DNA와 결합하게 된다. Supercoiled DNA에서 negative superhelical turn은 차차 제거되고 반지름이 증가하게 되어 이동속도는 느려지게 된다. Superhelical turn이 남아있지 않은 적절한 색소의 농도에서 이동속도는 가장 느리다. 여기에 더 많은 ethidium bromide가 첨가되면 positive superhelical turn이 생기게 되고 DNA 분자는 더 치밀해지며 이동속도는 급속도로 빨라진다. Linear와 open circular DNA의 이동은 DNA가 중성의 전하를 띠거나 ethidium bromide에 의해 굳어지는 경우에 이동속도가 느려진다.

* 낮은 전압에서 선형으로 된 DNA 조각의 이동속도는 부하되는 전압에 비례한다. 그러나, 전기장에서 전류의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA 조각의 이동속도는 빨라지게 되므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA 분리 효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA 조각들의 분리를 최대로 하기 위해서는 agarose gel에 5 V/cm 이상의 전압을 부하시켜서는 안된다.

A. Agarose gel 전기영동

실험방법

1. 깨끗하고 건조한 유리판(또는 전기영동 기구에 꼭 맞게 만들어진 플라스틱판) 사방 모서리를 주형의 모양이 되도록 테이프로 감은 후 수평으로 맞추어진 판 위에 주형을 둔다.

* 테이프로 감을 필요가 없는 기구가 요즈음 많이 시판되고 있다.

2. 전기영동 tank를 채우고 gel 제조에 이용하기 위한 전기영동 완충용액(1x TAE)을 충분히 준비한다. 다음 표를 이용하여 분리하고자 하는 DNA 크기에 해당하는 양의 agarose 분말과 완충액을 삼각 플라스크 또는 유리병에 담는다.